分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2024-03-05
Zhang, Ming
Tang, Chao
Wang, Zichun
Chen, Shanchuan
Xu, Mengying
Li, Kaiju
Sun, Ke
Zhao, Changjian
Wang, Yu
Dai, Lunzhi
Lu, Guangwen
Shi, Hubing
Chen, Lu
Geng, Jia
摘要： Single-molecule discrimination among amino acids is crucial to the realization of next-generation protein sequencing. Owing to the heterogeneous charge and subtle volume difference of underivatized amino acids, it remains a challenge for single-molecule techniques to recognize each of them. Here, we report the direct detection of twenty proteinogenic amino acids using a copper(II)-functionalized MspA nanopore. The binding sites for copper(II) ion are constructed by introducing histidine mutation (N91H) to M2MspA protein. With copper ion binding to histidine residues, amino acids can reversibly coordinate the copper-histidine complex, generating well-defined current signals. Using this strategy, all twenty amino acids can be detected. Assisted by a machine learning algorithm, we can identify 100% of signals with 70.2% accuracy or 60% of signals with 93.4% accuracy in the validation set. In successively addition experiment, each amino acid in a mixture of 10 amino acids can be identified precisely. Furthermore, we use carboxypeptidase A1 to partly release the C-terminal amino acids of peptides with different lengths (9, 10 and 22 residues). The hydrolysates of peptides can be identified and distinguished. These results demonstrate the feasibility of this system for amino acids detection and peptide identification, shedding new lights on the development of single-molecule protein sequencing.
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-05-06
摘要： 萜类化合物具有可观的商业价值，但生产过程复杂，产量低，利用微生物异源合成萜类化合物已成为热点。谷氨酸棒状杆菌内含合成萜类色素的途径，具有异源合成萜类化合物的天然优势和研究前景。首次对谷氨酸棒状杆菌合成萜类化合物进行了综述，从萜类合成途径、关键酶和全局调控机制三个方面进行了途经介绍。概述了谷氨酸棒状杆菌中单萜、倍半萜、四萜类化合物的异源合成，并对利用谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物所需解决的问题进行讨论，为谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物提供建议。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-04-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440中的6-羟基烟酸（6HNA）3-单加氧酶（NicC）是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行了活化，从而使得吡啶环可在双加氧酶催化下开环最终被完全降解。本研究通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量，进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现，NicC的最适反应温度为30℃-40℃，最适反应pH为8.0。Cd2+离子对于NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25 mM的时候，底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1 U/mg，Km值为51.8 μM；当6HNA的浓度为0.25 mM的时候，底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79 U/mg，Km值为15.0 μM。通过HPLC和LC-MS分析表明，NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）和甲酸，另外可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。该研究为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用新型纳米森林材料，构建一种操作简单、检测快速、灵敏度高的用于现场检测的自驱动微流控芯片。方法：利用MEMS加工技术制备出具有优良光学性能和大表面积的石英纳米森林结构微流道，对该纳米森林结构的高度、宽度/横向尺寸、密度、表面积、光学性能、毛细驱动效果、荧光增敏效果做出评价,利用双抗体夹心的方法进行蓖麻毒素的检测。结果：纳米纤维锥底直径约200~300nm，高度约1.0um，纳米森林的密度约为10个/μm2，估测表面积比底面积达5:1以上。其在波长为680nm处的透光率达89.5%，驱动流速约5mm/s，与平面结构相比，其饱和荧光显色成倍提高。蓖麻毒素的检测限低于10 pg/ml，在 10~6250pg/ml范围内具有较好线性关系。结论：基于纳米森林结构，成功构建了一种具有超大表面积和高灵敏度的毛细自驱动微流控芯片。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 跨国种业企业第三次大规模的兼并重组形成了新一轮的国际种业竞争格局，而知识产权保护则是跨国种业公司兼并重组的最大动力之一。研究跨国种业公司并购形成的核心知识产权的积聚重组，更能深度考察国际种业竞争新格局的变化趋势。趋势之一，美日欧三国仍然是全球育种研发创新活动的主导者和垄断者，大规模的兼并重组，实现了技术和资源的整合，提升了国际种业集中度，全球种业42.75%的专利申请量集中在美国、日本和欧盟，并且掌握着全球64.68%的DNA重组技术专利。趋势之二，知识产权已经成为跨国种业公司保持市场竞争优势的有力武器，跨国种业公司是核心种业技术专利的拥有者，拜耳/孟山都、中国化工/先正达和杜邦先锋/陶氏的育种专利申请量占全球总育种专利申请量将近14%，全球农作物的转化体81%以上被跨国种业公司所掌握。对国际种业新格局的变化趋势进行研究分析，可以为我国种业兼并重组提供有价值的政策建议。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：构建产fusaruside的毕赤酵母菌株，解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法：从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因—3位去饱和酶（Δ3(E)-SD）和10位去饱和酶（Δ10(E)-SD）基因；并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体，转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达；对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果：3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达，SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48 kDa，10位去饱和酶分子量约为65 kDa；HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论：与fusaruside原产菌株镰刀菌相比，该酵母菌的发酵时间更短，产量更高，为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 【目的】 通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用，探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。【方法】 生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7，通过成功构建载体ATG7野生型（pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT）和突变型，利用双荧光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系，同时构建结核分枝杆菌（H37Ra）感染的人源性THP-1巨噬细胞模型，将做不同处理的细胞分为三组：miR-17-5p mimics，miR-17-5p inhibitor，miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响，并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。【结果】 MTB感染能够引起miR-17-5p的下调，随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性，双荧光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合，并对其进行负调控。进一步通过Western blot，免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调，自噬小体表达降低，而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较，ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。【结论】 miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬，在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型，初步分析其表型并研究OTUB1基因与肝脏代谢的关系。方法：利用Cre/Loxp系统构条件性基因敲除小鼠模型，即将OTUB1fl/fl转基因小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代自交，得到OTUB1肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。取同窝对照小鼠（control, NC）和肝特异型基因敲除（hepatic-specific OTUB1 knockout, HCKO）小鼠，通过PCR和免疫印迹（Western blot, WB），确证OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型是否成功构建。通过组织病理学方法，分析主要组织器官的形态以及是否存在自发的病变；通过血清生化指标检测肝脏脂代谢水平；通过血糖耐受实验（GTT）分析HCKO小鼠对血糖的控制。结果：基因组测序和WB检测结果显示HCKO小鼠肝脏中OTUB1被敲除，其他组织中OTUB1表达水平无变化，证明OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型构建成功。HCKO小鼠出生正常，各组织器官无异常，生化指标中总胆固醇水平明显降低，表明OTUB1影响肝脏脂代谢水平。糖耐受实验中HCKO小鼠血糖回落迅速，表明敲除OTUB1影响肝脏血糖调节稳态。结论：应用Cre/Loxp技术成功建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究OTUB1在肝脏的生理功能和调控机制提供了重要的动物模型。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：木聚糖（Xylan）在自然界中的含量极其丰富，在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显，对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶（Xylanase）是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶，近年来，为了实现木聚糖酶的高产、高酶活表达，科研工作者做了大量的研究工作，本文将就木聚糖酶异源表达（Heterologous expression）的研究进展进行综述。 关键词：木聚糖；木聚糖酶；异源表达
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：以毕赤酵母为异源表达宿主合成人胰岛素前体，在实验室研究和工业生产中已有广泛应用。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子，以甲醇为单一基础碳源进行胰岛素前体的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产过程中，甲醇代谢过程耗氧大、产热高，补料控制工艺复杂，限制了发酵生产的放大。本研究基于我们前期对启动子AOX1的转录调控设计研究，提出以人工设计的高效组成型转录调控器件CSAD_5驱动胰岛素前体基因表达，开发了葡萄糖为碳源的发酵生产工艺，以解决甲醇体系中的产热、耗氧以及工艺控制问题。在此基础上，通过增强筛选压力提高异源基因拷贝，获得了一株胰岛素前体高表达重组毕赤酵母，利用优化的培养工艺在5 L反应器水平发酵生产，胰岛素前体产量在108 h达到1.85 g/L，为目前报道以葡萄糖为碳源，生产人胰岛素前体的最高水平。该研究为胰岛素前体的工业生产以及毕赤酵母的应用提供了新的思路和方法。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：高分子囊泡作为一种新型的纳米药物载体，具有生物可降解性、稳定性、生物相容性以及可修饰的多功能化等特点。改变聚合物种类和亲水-疏水嵌段的比例，可以制备具有不同形态和膜特性的高分子囊泡。经过修饰后的高分子囊泡，可赋予其更多的功能，从而实现药物的控释和药物靶向的能力。本文对高分子囊泡的结构、组成和制备方法以及在药物释放体系的应用等方面进行了较为详细的综述，目的是了解高分子囊泡最新研究进展以及未来科学家们亟需要解决的重要问题。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 外泌体是细胞内源性囊泡样生物纳米级膜结构，直径大小在40-100 nm之间，可由各种类型的细胞分泌释放。外泌体具有许多功能，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类的细胞间运输和传递，以及抗原递呈，还可能具有致癌的能力。肿瘤细胞所分泌释放的外泌体在肿瘤的发生、发展以及迁移等生理和病理过程中发挥重要的作用。目前从肿瘤外泌体中寻找特异性标志物已成为肿瘤研究者重点关注的方向，对肿瘤早期诊断、疗效评价和预后分析具有重要的意义。本文作者就近年来外泌体在肿瘤研究和诊断中研究进展进行综述。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 通过目的基因的随机整合方式，构建得到的CHO表达细胞系，常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域，而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象，这主要是由于位点效应所导致。为了解决这个问题，现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组，将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上稳定表达区域，以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。现总共利用该技术获得了2株外源基因（人白蛋白基因）定点整合细胞系；western blot结果显示，细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性；细胞在贴壁状态下，两株细胞系在第3、12、23、35、50代，细胞每日表达的HSA质量接近，且均维持在0.5 pg/cell/day；选取一株表达细胞系，经悬浮驯化后，在批次条件培养下，第1、25及50代的悬浮细胞，在摇瓶内的表达浓度均稳定在13-14 mg/L。本研究显示了将外源基因基因定点整合于CHO细胞基因组内的的可行性；且外源基因整合在稳定表达区域后，重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶 (PvEH1) 针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性，并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点，通过单点和组合突变对PvEH1进行改造，以期改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚 (1a) 的催化特性。底物谱分析表明PvEH1对1a的催化活性 (157.2 U/g湿细胞) 和对映选择性 (E = 5.6) 最高。单点突变结果显示E. coli/pveh1L105I和E. coli/pveh1V106I对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高；L105I和V106I位组合突变菌株E. coli/pveh1L105I/V106I的催化活性 (493.8 U/g湿细胞) 是E. coli/pveh1的3.1倍，对映选择性 (E = 8.3) 也提高至E. coli/pveh1的1.5倍。纯化后PvEH1L105I/V106I的催化活性为17.6 U/mg是PvEH1的1.5倍，对1a的催化效率提高至PvEH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白的可溶性表达量。利用E. coli/pveh1L105I/V106I全细胞催化100 mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯 (R)-1a (ee > 96%) 的产率和时空产率分别为31.2%和5.12 g/L/h，因此，在手性纯 (R)-1a的制备中，E. coli/pveh1L105I/V106I是一种颇具潜力的生物催化剂。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 肿瘤免疫治疗是通过调节机体的免疫功能来控制和杀伤肿瘤的一种治疗手段。针对免疫检查点的治疗等一系列临床突破使得肿瘤的免疫治疗受到了广泛重视。目前，抗体治疗和过继性细胞治疗是肿瘤免疫治疗的主要方式，但是这些方法仍具有副作用较强，实体瘤治疗难以实现，治疗费用高昂等缺点。因此改进和发展更加高效、安全、低成本的新技术仍十分必要。适配体是利用指数富集的配体系统进化技术筛选得到的单链寡核苷酸，有核酸“抗体”之称。适配体具有低免疫原性，组织穿透力强，易于化学合成与修饰等优势，且与其靶标的结合具有较好亲和力和特异性，可像抗体一样实现肿瘤的免疫治疗。本文对适配体在肿瘤免疫治疗相关技术中的新应用作一综述，主要包括基于免疫检查点的抗肿瘤作用、双特异性适配体的肿瘤免疫治疗、适配体靶向递送siRNA的肿瘤免疫治疗和适配体联合抗体的肿瘤免疫治疗几个方面。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 利用甲醇营养型毕赤酵母生产猪干扰素（pIFN-），诱导过程一般在高细胞密度、定值控制甲醇浓度于5-10 g/L下进行，此时、溶解氧浓度（DO）自然下降到接近于0的水平。如果高好氧的毕赤酵母长期处在高甲醇/低DO的诱导浓度环境会导致其代谢活性恶化；胞内甲醇积累严重；pIFN-表达生产效率低。为此，提出了一种甲醇周期诱导控制策略来强化pIFN-生产。先将甲醇控制于高浓度达7 h；再降低甲醇流加速率、将DO控制在~20%约4 h，一共重复6个循环。采用上述周期控制策略，毕赤酵母代谢活性可以长期维持在较高水平；胞内甲醇处于极低水平（≤ 0.003 g/g-DCW）、解除了甲醇毒性效应；pIFN-活性达到3.90×107 IU/mL的最高水平，是定值控制甲醇浓度时的1.86倍。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 固定化酶作为一种绿色高效的生物催化剂，其性能远超游离酶。目前酶的固定化技术适用范围仍然较小，酶的研究范围多停留在模型酶阶段，扩大固定化酶的研究范围具有十分重要的意义。金属有机骨架材料（MOFs）作为酶固定化的载体在近些年得到了广泛的探索，但是具有生物功能的酶-MOFs复合材料的许多特性仍有待挖掘。本文采用仿生矿化的合成方法将5-羟甲基糠醛氧化酶（HMFO）固定到以沸石咪唑酯（ZIF-8）为代表的MOFs材料中，制备得到一种新的生物催化剂HMFO@ZIF-8，扫描电子显微镜表征其形态区别于经典的菱形十二面体。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，计算得到酶的固定化效率达到89.0%。HMFO@ZIF-8催化5-羟甲基糠醛的转化率达到84.3%，收率和选择性均高于游离酶。本文拓展了MOFs固定化酶的研究范围，为研究其他生物大分子复合材料的生物催化剂提供一定的借鉴意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：基于GC-FID法，对狂犬病疫苗生产过程中采用的β-丙内酯灭活剂进行了含量及稳定性研究。方法：气相色谱条件：采用Agilent DB-624（30 m×0.530 mm×3.00 μm）毛细管柱；升温程序：初始温度为80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持3 min；色谱柱流量：3 mL/min；检测器温度：250 ℃；进样口温度：150 ℃；载气：氮气，线速度：25 cm/sec；进样量：1 μL，分流比为2:1，进样方式：手动进样。结果：以乙腈作为稀释剂，BPL在1:100～1:32000范围内线性关系良好（R2≥0.999）。在1:200、1:1000、1:8000 三个浓度水平下，加标回收率在95.04%～116.86%之间，相对标准偏差（RSD）为2.6%～3.2%，检测限为0.112 μg/mL。结论：该方法简便、专属性强、稳定且在室温条件下操作，大大降低了对试验条件和技术操作的要求，能够满足灭活狂犬病病毒工艺中对BPL检测的需求。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 细菌中普遍存在L/D型氨基酸，与L-氨基酸（L-AAs）不同，D-氨基酸（D-AAs）不参与蛋白质合成，而与细胞壁肽聚糖的合成有关，直接影响细菌细胞壁的形状、数量和强度。D-AAs在细菌表征、药物抑菌性、靶标确定等方面具有重要的作用。目前，外源添加D-AAs参与肽聚糖合成的机制已有一些研究进展，其荧光衍生物已应用于细菌可视化，特异性探测细胞壁形成/重塑、细菌生长和细胞形态。但D-AAs如何影响细菌生长及其抗逆性的机制尚未研究清楚。本文对D-AAs的研究现状进行了综述，重点介绍了D-AAs在细菌中的生物合成和参与细胞壁合成的机制，非典型D-AAs对细菌的调控以及在细菌可视化中的应用，并对D-AAs未来研究方向进行了展望。
分类： 医学、药学 >> 临床医学 分类： 生物学 >> 生物工程 分类： 物理学 >> 电磁学、光学、声学、传热、经典力学和流体动力学 提交时间： 2019-01-15
Qiang Tang
Wei Zou
Zuodong Sun
Kang Li
Wuyi Sun
Wenhua Wang
Yanli Xing
Xueping Yu
Jing Bai
Xiuying Teng
Yan Hou
摘要： [Objective] Evaluate on the treatment efficacy and safety for transcranial magnetoelectric encephalopathy treatment instrument (brand name: AOBO Parkinson’s Treatment Instrument) treatmenting parkinson's disease. [Methods] Use methods of double center,randomized, double blind, self crossover, 22 Parkinson’s patients who met the inclusion criteria were randomly divided into A group and B group, then were carried on the curative effect analysis, and were observed therapeutic effect. [Results] The treatment group of 22 cases, basically cured in 0 cases, markedly effective in 9 cases, effective in 8 cases, ineffective in 5 cases. The total efficiency rate and total effective rate were 40.91% (9/22) or 77.27% (17/22) respectively. The control group of 22 cases, basically cured in 0 cases, markedly effective in 2 cases, effective in 3 cases, ineffective in 17 cases. The total efficiency rate and total effective rate were 9.09% (2/22) or 22.73% (5/22) respectively, the total effective rate and total effective rate in the treatment group were higher than those in the control group, the difference was statistically significant (P0.05); There was significant difference between the treatment group and the control group (p<0.05). [Conclusions] Transcranial magnetoelectric stimulation can significantly improve resting tremor, muscle rigidity, bradykinesia in patients with Parkinson’s disease and other symptoms, and the use of safety. "
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