分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2018-06-15 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株，为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础。方法根据CRISPR/Cas9 靶向原理设计并合成3 个特异性识别4.1R 基因的向导RNA（sgRNA），构建sgRNAlentiCRISPRv2 重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒，慢病毒侵染RAW264.7细胞，嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆，Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达，测序确认单克隆细胞中突变位点。结果Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失；测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了 19bp的缺失突变；并且4.1R基因敲除后，RAW264.7细胞的增殖能力显著增加。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达，为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-27 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 筛选小鼠黑色素瘤细胞中蛋白4.1家族的表达，探讨蛋白4.1对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响。方法 以MEF、B16、B16-F10细胞基因组RNA和总蛋白为模板，经PCR法和Western blot筛选蛋白4.1在小鼠黑色素瘤细胞中的表达；通过分子克隆构建真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3并转染黑色素瘤细胞；检测表达蛋白4.1B后 B16、B16-F10细胞增殖的变化。结果蛋白4.1B在黑色素瘤细胞中表达缺失；通过转染成功构建的真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3发现，表达蛋白4.1B的黑色素瘤细胞的增殖作用被显著性抑制。结论 通过真核表达载体 pEGFP-N1-EPB41L3 转染表达蛋白 4.1B 可显著抑制 B16 和B16-F10黑色素瘤细胞的增殖。
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