利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2

分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-06-27 合作期刊: 《中国生物工程杂志》

黄 鹏 闫丽萍 张宁 石金磊

摘要： 利用甘油醛三磷酸脱氢酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAP）启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2（human goose-type lysozyme 2，hLysG2），并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2（recombinant hLysG2，rhLysG2）生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因，将其连接至pGAPZA 质粒中，构建重组表达质粒pGAPZA-hLysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株，并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60 h后发酵液上清酶活性达到最高， 发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达。与诱导型表达相比，组成型表达发酵时间缩短了48 h，上清中rhLysG2总活性提高了23.8%；使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后，每升发酵液上清可纯化到187.4 mg重组蛋白，纯化产物纯度达99.0%以上；浊度测定法分析显示，在pH 5.6、30℃和0.1 mol/L Na+的条件下，rhLysG2可达到最大酶活性13500 U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rhLysG2，避免了甲醇的使用，缩短了发酵时间，提高了蛋白产量，为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。

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