分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 蛋白质过量表达的调控研究中，关于基因转录、蛋白质修饰、折叠和分泌途径的分子机理研究及其在蛋白合成调控中的应用已经较为广泛。由于核糖体结构存在复杂性，关于蛋白质过量表达在核糖体翻译水平的研究及调控的报道较少。 毕赤酵母作为蛋白质表达和生产的重要工业菌株，已成为蛋白质高效表达调控研究的重要对象。在过去的研究中通过选择高效启动子提高蛋白质基因转录水平，过量表达内源UPR相关因子提高蛋白质折叠水平，优化分泌信号肽均能达到提高蛋白质合成与表达量的目的。前期研究在蛋白质过量表达的毕赤酵母细胞中发现了大量核糖体蛋白表达下调及细胞生长下降的现象，对核糖体蛋白及核糖体结构功能进行深入分析，有望从翻译水平上研究核糖体蛋白对细胞蛋白质过量表达的分子调控机理。 本课题使用iTRAQ LC-MS/MS技术分析重组毕赤核糖体蛋白及能量代谢途径的差异表达，发现在过表达木聚糖酶过程中有30个核糖体蛋白出现下调。对表达下调的核糖体蛋白进行基因缺失构建毕赤酵母突变菌株，通过Cre/loxp筛选标记可重复利用基因敲除系统在毕赤酵母GS115宿主中进行核糖体蛋白突变菌株的筛选及功能研究，成功获得了RPL22∆、RPL24∆、RPL26∆等28个核糖体蛋白突变菌株。分别以增强型绿色荧光蛋白egfp及植酸酶phy作为报告蛋白，初步分析突变株的细胞生长特性与蛋白质合成效率，并测定分析了其多聚核糖体图谱，结果表明缺失核糖体蛋白对细胞生长与蛋白质过量表达有不同程度的影响，且可使细胞翻译活性大幅下降。结合翻译组学和蛋白质新生肽链折叠稳定性分析，研究结果表明非必需核糖体蛋白缺失影响核糖体对蛋白质的翻译起始速率与延伸速率,进而影响蛋白质共翻译折叠效率，从蛋白质的合成质量上调控其产量，为进一步分析核糖体蛋白对翻译、内质网胁迫耐受及蛋白合成分泌等功能的影响和深入探讨核糖体蛋白对重组毕赤酵母细胞生长及蛋白质过量表达的分子调控机制提供基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展迅速的一种高效表达的宿主菌。毕赤酵母属甲醇营养型酵母，具有操作简便、易于高密度培养、生长迅速、对翻译后的蛋白进行加工、生产成本低等优点。毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可进行胞内表达或分泌表达。利用基于同源重组的DNA转化系统将基因整合进基因组是目前最重要的基因编辑手段之一，已经被广泛应用于毕赤酵母中；但毕赤酵母面临着筛选标记不足的难题。 在Cre/loxP系统中，当两个loxP位点以顺时针相同的方向放在一段序列之间时，Cre酶能识别并切除该序列，留下一个loxP位点。当使用突变的loxP序列（例如lox71和lox66），当被Cre重组酶识别并进行作用后，会留下一个新的突变的lox72位点，并不会与下次引入的loxP位点进行作用，从而避免了残留的loxP位点与新引入的loxP位点被Cre重组酶识别的可能。 本文通过在毕赤酵母通用质粒pPICZA和pGAPZA的基础上，在博来霉素抗性基因表达盒后融合了诱导表达Cre的表达盒，并在这两个表达盒前后引入了lox71和lox66位点，分别构建了质粒pZACH和pGACH；进而进行筛选标记循坏利用。具体过程如下：1、质粒转化毕赤酵母，使用博来霉素进行抗性筛选得到阳性转化子；2、将阳性转化子接种于含有诱导剂甲醇的YPM培养基中，培养过夜；3、将培养过夜的含菌体的培养基划线于不含抗生素的YPD平板上，培养至酵母单菌落可见；4、将3中的酵母单菌落同时点种于不含抗生素的YPD平板和含博来霉素的YPDZ平板上，如能在YPD平板上生长而不能在YPDZ平板上生长，则说明该菌落的博来霉素抗性表达盒已丢失，再使用PCR鉴定进行验证。整个抗性素标记丢失需要约4-5天。 使用质粒pZACH分别在毕赤酵母中表达了来源于柠檬酸杆菌（Citrobacteramalonaticus）CGMCC 1696的植酸酶和来源于抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens） CMC-1的脂肪酶，这些质粒的抗性素标记丢失效率均大于70%，而且植酸酶和脂肪酶的产量与菌体生长都和使用基础质粒pPICZA进行表达的结果相似。该质粒对外源蛋白表达以及菌体生长并无不良影响。 使用筛选标记循坏利用质粒pZACH和pGACH，可以克服毕赤酵母中筛选标记不足的缺点，便于更好地在毕赤酵母中进行基因改造，从而为毕赤酵母的进一步工业应用提供基础。
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