分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-27 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 根据CDC42蛋白二级结构，设计CDC42 siRNA干扰片段，构建CDC42稳定干扰shRNA载体。观察CDC42有效沉默对结直肠癌SW480细胞形态的影响。方法 根据CDC42基因CDS区序列，设计4条 siRNA片段。Western blot筛选最有效沉默片段，酶切插入真核表达载体，将构建的shRNA质粒载体，瞬时转染结直肠癌SW480细胞，QPCR及Western blot验证CDC42沉默效率；观察转染前后，SW480细胞形态变化。结果 4条siRNA转染细胞后，验证结果显示siRNA-3沉默效率大于50%，沉默效果最好，将此片段插入真核表达载体，测序结果提示CDC42 shRNA构建成功，转染SW480细胞后，CDC42基因mRNA及蛋白水平表达明显下降，差异有统计学意义；显微镜观察CDC42沉默后，SW480细胞周边伪足伸出减少，细胞变光滑，细胞整体体积明显减小。结论 成功根据基因序列设计有效沉默片段，构建CDC42稳定沉默载体，证实CDC42沉默可以逆向改变结直肠癌细胞高侵袭性形态，为研究CDC42对结直肠癌的发生、发展提供分子工具。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的了解血小板源性生长因子-BB(PDGFBBB)对大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞增殖、迁移及表型转化的影响并初步探讨其作用机制。方法采用改良的组织块培养法培养Wistar大鼠CCSM细胞，并用细胞免疫荧光法鉴定。利用CCK-8法检测不同浓度的PDGFBB对培养的大鼠CCSM细胞增殖的影响，并筛选出最适PDGFBB作用浓度。分别用0ng/mL PDGFBB与最适浓度PDGFBB处理CCSM细胞，利用划痕实验检测PDGFBB对CCSM细胞迁移的影响，24h和48h时利用qRT-PCR检测细胞中转录因子myocardin及收缩型表型标志物。a-SMA、SMMHC mRNA表达水平;用最适浓度PDGFBB处理CCSM细胞0、24和48 h后，利用western blotting检测细胞中myocardin的蛋白表达水平。结果原代培养的CCSM细胞中。a-SMA和smoothelin阳性率分别约为96.5%和96%;不同浓度的PDGFBB均能明显促进CCSM细胞增殖，其最适浓度为12.5 ng/mLPDGFBB(12.5 ng/mL)能促进CCSM细胞迁移，下调CCSM细胞中myocardin ,a-SMA和SMMHC mRNA表达水平(P均<0.01) ;在48 h内myocardin蛋白质的表达水平随着PDGFBB作用时间增加而降低。结论改良的组织块培养法可获得高纯的CCSM细胞;PDGFBB可促进CCSM细胞增殖、迁移，使细胞从收缩型向合成型转化，其机制可能是通过下调myocardin。
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