分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：以c-Myc-GST蛋白为靶分子，从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签（EQKLISEEDL）的纳米抗体。方法：采用固相淘选技术，筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体，phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序，通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b（+），转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果：通过4轮固相淘选，具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集，回收率提高了145倍，阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达，SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达，表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签，量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论：成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆，构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达，为检测胞内c-Myc蛋白奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：以c-Myc-GST蛋白为靶分子，从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签（EQKLISEEDL）的纳米抗体。方法：采用固相淘选技术，筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体，phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序，通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b（+），转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果：通过4轮固相淘选，具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集，回收率提高了145倍，阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达，SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达，表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签，量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论：成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆，构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达，为检测胞内c-Myc蛋白奠定基础。
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