分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-27 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 建立抑制肠上皮细胞基因组中Muc2基因表达的 CRISPR/Cas9系统并探索粘蛋白 Muc2在鼠李糖乳杆菌 GG株（LGG）抑制大肠杆菌 K1（Escherichia coli, E.coli k1）株 E44黏附和侵袭肠上皮中的作用机制。方法 设计 2个长 20~25 bp的sgRNA分别靶向Muc2，合成sgRNA寡核苷酸序列并构建CRISPR表达载体，转染野生型人结肠癌Ht29细胞，蛋白免疫印迹法检测抑制效率及通过MTT法检测其细胞活力及生长情况后，竞争性排斥分析验证粘蛋白Muc2在益生菌抑制E44黏附侵袭肠上皮中的作用。结果 目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中且序列正确；稳定抑制Muc2表达的细胞株筛选成功；Muc2基因沉默后，与空白对照组相比，其表达水平明显降低，抑制率可达81%（P<0.01）；黏附侵袭实验中E44相对黏附率为 72.23%（P<0.01），相对侵袭率为 81.49%（P<0.01），益生菌 LGG的抑制 E44黏附和侵袭作用明显下调。结论Muc2基因下调明显降低益生菌抑制E44黏附和侵袭肠上皮细胞的能力，提示益生菌刺激Muc2表达上调可能是其强化加固肠粘 膜屏障和拮抗致病菌功能的关键性机制之一，并可为肠道细菌性感染疾病的预防治疗提供了一个新手段。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-27 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的 探讨c-Met受体阻断剂卡博替尼（Cabozantinib, XL-184）能否抑制产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）进入Caco-2细胞并降低对细胞的损伤。方法 通过侵袭实验研究XL-184在抑制LM进入Caco-2细胞中的作用，并研究剂量及时间与侵袭率的关系；Caco-2细胞种植于Transwell上室，LM感染单层Caco-2细胞，然后在上室中加入辣根过氧化物酶（HRP），通过测定跨上皮细胞电阻（TEER）值及计数从上室渗透到下室的LM数量和HRP浓度，预测X-184对单层细胞通透性的保护作用；检测乳酸脱氢酶（LDH）释放水平推测细胞膜的渗透性；荧光染色鉴定细胞活性。结果 相比对照组，侵袭实验显示，XL-184处理组的LM侵袭率明显降低（P=0.000），且侵袭率随XL-184浓度和作用时间的增加而显著降低，联合用药效果优于单独用药（P<0.05）。细胞通透性实验表明，XL-184可明显抑制LM诱导的跨上皮细胞电阻（TEER）的降低 P<0.05），并可降低辣根过氧化物酶和细菌介导的细胞通透性（P=0.000）；细胞活性实验表明，XL-184可提高细胞存活率（P<0.01）；同时，可显著降低LM诱导的LDH释放（P<0.05）。结论 XL-184可能在抑制LM侵袭Caco-2及降低LM诱导的Caco-2损伤中起重要作用。因此，XL-184有望成为潜在的治疗和预防李斯特菌感染的有效药物。
分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》
摘要： 目的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans, Cn)荚膜主要毒力因子透明质酸由CPSI基因编码，能与宿主细胞受体CD44结合介导真菌侵袭。本文目的明确CD44分子在Cn体外感染血脑屏障模型中对单核细胞豁附人脑微血管内皮细胞(HBMEC)并迁移穿越血脑屏障的影响。方法用单层HBMEC铺趋化小槽构建体外血脑屏障模型，利用Cn野生株B4500F02,CPS1基因缺失株TYCC645#32和CPS1基因回补株PCIP，分别感染模型中的HBMEC，然后在上槽液中加入人白血病单核细胞((THP-1) ,计数从上槽液中迁移到下槽液中的单核细胞数量，观察Cn感染与单核细胞迁移时间和剂量关系;用抗CD44单克隆抗体和CD44抑制剂Bikunin分别作用于模型中单层HBMEC，通过趋化实验检查抗CD44单克隆抗体和Bikunin对Cn感染模型中单核细胞迁移的抑制效应。结果豁附和趋化实验结果显示，Cn感染HBMEC后，相比PBS对照组，THP-1黍占附率和趋化效应均明显增加(P<0.01)，且豁附率和迁移率随Cn感染量和感染时间的增加而显著上升(P<0.05)。通过抗CD44单克隆抗体和CD44阻断剂Bikunin分别作用于Cn感染后的HBMEC，结果发现THP-1黍占附率和迁移率均显著降低(P<0.01)，且在一定范围内分别随抗体(0~1μg)和抑制剂(0-20 nmol/L)剂量的增加而减低。不同Cn菌株荚膜透明质酸的表达差异对THP-1细胞豁附和迁移有一定影响:与野生株相比，TYCC645#32感染组的THP-1黍占附率和迁移率均明显降低(P<0.01, P<0.05 )，而回补株PCIP的THP-1黍占附率和迁移率有所增加。结论体外血脑屏障模型中人脑微血管细胞表达CD44分子可能对单核细胞豁附内皮细胞和迁移通过血脑屏障起重要作用;荚膜透明质酸能介导Cn诱导的单核细胞豁附和迁移。
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