分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒pET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coil BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDS-PAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43 kDa的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25 ℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75 U/mL,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744 mmol/L,Vmax为0.143 mmol/L/min,相对于ATP的Km值为2.266 mmol/L,Vmax为0.318 mmol/L /min。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒pET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coil BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDS-PAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43 kDa的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25 ℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75 U/mL,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744 mmol/L,Vmax为0.143 mmol/L/min,相对于ATP的Km值为2.266 mmol/L,Vmax为0.318 mmol/L /min。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。