分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： R-2-卤代酸脱卤酶能立体选择性水解R-2-卤代酸。解析酶的单晶结构对提高酶的选择性和活性提供了直接的结构指导，是目前酶结构领域研究的前沿。以实验室前期得到的来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶（DehDIV-R）为研究对象，采用X射线衍射晶体法进行结构解析。采用ppSUMO载体融合表达DehDIV-R蛋白，依次通过Ni-NTA亲和层析、透析酶切、二次Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤层析纯化得到单一条带，且均一性好的蛋白。接着对结晶条件进行初筛与优化，得到的最佳结晶条件为0.1 mol/L HEPES pH 7，12% PEG 6000，0.2 mol/L MgCl2 ，8 mmol/L CHAPS。晶体在上海同步辐射光源BL18U1线站上收集衍射数据，采用分子置换法成功解析获得了分辨率为2.35 Å的DehDIV-R的晶体结构。Ramachandran图表明98.02%的氨基酸位于最适区，证明了该结构的合理性。DehDIV-R的纯化、结晶以及结构解析为进一步深入了解其结构和功能奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： (S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯（(S)-CHOH）是他汀类药物合成的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成(S)-CHOH是很有潜力的制备路线，目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低。首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH（A94T/F147L/A202L/L199H）进行回复突变，确定了关键位点147和202位，并获得比酶活提高1倍的突变体M F147L-A202L。对这两个位点进行饱和突变，获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体M F147I-A202L。其比酶活为10.17U/mg，为目前文献报道最高水平。通过动力学分析和分子对接，分析了突变位点对酶活影响的机理，为后续研究奠定了良好的基础。
点击量
点击量
下载量
评论
