人Bcl-6 3'UTR区报告质粒及其表达载体的构建和功能检测

分类： 医学、药学 >> 基础医学 提交时间： 2017-12-07 合作期刊: 《南方医科大学学报》

韩白玉 崔瀚之 燕翔 黄鹏 黄华龙 范忠义 窦京涛

摘要： 目的 通过构建bcl-6基因野生型、突变体3'UTR区及其编码序列（CDS），观察miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用及bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法 利用PCR方法扩增bcl-6基因 3'UTR区序列及其CDS，分别构建在pcDNA3.0-Luc和pcDNA3.0-Flag载体上，在bcl-6基因3'UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点突变的突变体报告基因质粒，应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用，在肝癌细胞HepG2中检测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变，同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平，检测bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果 构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确，bcl-6 3'UTR野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和HepG2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报告质粒的活性，但对突变体活性没有影响，miR-127可引起HepG2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长，bcl-6可以逆转miR-127对细胞周期和细胞生长的影响。结论 成功构建bcl-6基因3'UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体，荧光素酶报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。

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