分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶，也是两种重要的饲用酶制剂，本研究利用毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶ManA共表达重组质粒pPICZαA/DSB-ManA，将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/ DSB-ManA，实现了两种酶的共分泌表达，经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273.6 U/mL和256.8 U/mL，为单独表达重组菌X33/DSB和X33/ManA酶活的30.4%和73.4%。酶学性质的分析显示DSB和ManA的最适反应温度均为75℃，在45℃-75℃范围内具有较好的温度稳定性，酶活可保持最高酶活的60%以上；DSB最适pH为6.5，ManA最适pH为6.0，在pH 3.0、40℃条件下，ManA处理1 h能保持最高酶活的80%以上，DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上；DSB和ManA对多种金属离子和化学试剂（浓度为1 mM）具有较好的耐受性，均可保留60%以上的酶活力。本研究利用单一菌株成功完成了不同酶的共表达，为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因（hyd）和D-氨甲酰水解酶基因（adc），构建重组细胞作为催化剂，用于生产D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）。方法：构建hyd表达质粒，考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因，考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子，构建hyd和adc基因共表达质粒，考察双酶活性菌株的催化特性。结果：成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS，培养基中添加0.8 mmol/L的MnCl2·4H2O，使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956 U/gDCW。整合表达Pcdd-acoR基因，使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1470 U/gDCW。单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建，菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40-45℃，催化活性能够持续12 h，当底物起始浓度为20 g/L时，反应12 h生成的D-HPG达到14.32 g/L，转化率达到95%，收率超过80%。结论：构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂，用于海因酶法生产D-HPG，具有技术上的可行性和优势。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶（DAR），同时构建辅酶NADH原位再生系统，利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法：PCR克隆多粘芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）dar基因，连到质粒pETDuet-1，转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR；通过HiTrap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白，测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统，协同表达枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH，并以此重组菌为全细胞生物催化剂，优化催化条件，提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果：获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-DAR和E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2.59 mM，1.64 μmol/L∙min∙mg，12.3 /s，还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95.86 %，具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后，重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料，乙偶姻产量达51.26 g/L，转化率81.37 %，生产速率5.13 g/(L∙h)。结论：使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻，以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻，不需额外添加昂贵的辅酶，具有较高的生产应用价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备，海藻糖转化率从50.4%提高至71.9 %。为进一步提高底物的转化率，运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷（EPS）显色法，最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白纯化，测定其酶学性质，结果表明：突变体的比活为345.25 U/mg，野生型则为357.63 U/mg；突变体M234I对麦芽糖的Km为0.2582 mM，仅为野生型（0.4749 mM）的54.4%，对麦芽糖的亲和性显著提高；突变体的最适温度，最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物，将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖，酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9 %，较野生型β-CGTase提高约3%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：证实酒精可诱导AC16心肌细胞凋亡及其与酒精浓度和作用时间的关系，研究不同浓度酒精干预下AC16心肌细胞中miR-186-5p与X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达水平以及心肌细胞凋亡水平的改变，探究miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。方法:流式细胞术检测细胞凋亡水平，Western Blot、实时定量PCR技术分别在蛋白及基因水平检测细胞miR-186-5p与XIAP表达水平的变化，双荧光素酶报告基因靶基因荧光检测miR-186-5p与XIAP的靶际关系。结果:酒精诱导AC16心肌细胞发生凋亡，且与酒精浓度及作用时间呈正相关；酒精摄入上调AC16心肌细胞中miR-186-5p表达,下调XIAP表达；miR-186-5p参与酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡过程，XIAP抑制酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡；miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。结论: AC16心肌细胞经过酒精处理后，细胞的凋亡水平升高，并且随着 酒精作用浓度和作用时间的延长，凋亡水平进一步升高；酒精处理后心肌细胞中miR-186-5p表达量上调，XIAP表达量下调，miR-186-5p以XIAP为靶基因，调控酒精处理后心肌细胞的凋亡。
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