谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用 后印本

摘要: 目的：建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法，并用于大肠杆菌氨基转移酶WecE突变库的筛选。方法：通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间，建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法；通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库；采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体，并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果：建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/mL L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法；构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库，通过96孔板高通量筛选，获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论：本研究建立了高通量筛选方法，背景干扰小，准确性高，为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。