基于IRES序列的多基因共表达载体构建

摘要: 目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体，实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达，提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架，设计并全基因合成双基因克隆表达元件，连接到骨架载体，构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100％。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达，并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。