sh1}NA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响

摘要: 目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法 根据文献报道的PAX6靶点序列， 设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列，引物退火形成带粘性末端的双链，与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒 载体进行连接、转化，构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体，再经菌落PCR及测序鉴定重组载体； 在293T细胞中包装病毒，将包装 后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞。Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平，Western blot检测PAX6蛋 白的表达，MTT法检测U251细胞增殖。结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大 片段，菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功，构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包 装，测得慢病毒滴度为6.73×108 TU/mL；Real-time PCR结果显示，沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显 低于正常对照组及慢病毒空载体组（P<0.05）；Western blot结果显示，PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组 （P<0.05）；MTT结果显示，与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较，感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞，细胞增殖 能力明显增强（P<0.05）。结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体，沉默PAX6基因的表达， U251细胞的 增殖能力增强。