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1. chinaXiv:201903.00139 [pdf]

MiR-17-5p靶向自噬相关蛋白ATG7调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染作用的研究

洪丹彤; 张帆; 王淑娥; 王红霞; 刘昆梅; 徐广贤; 霍正浩; 郭乐
Subjects: Biology >> Bioengineering

【目的】 通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用,探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。【方法】 生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7,通过成功构建载体ATG7野生型(pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT)和突变型,利用双荧光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系,同时构建结核分枝杆菌(H37Ra)感染的人源性THP-1巨噬细胞模型,将做不同处理的细胞分为三组:miR-17-5p mimics,miR-17-5p inhibitor,miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响,并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。【结果】 MTB感染能够引起miR-17-5p的下调,随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性,双荧光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合,并对其进行负调控。进一步通过Western blot,免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调,自噬小体表达降低,而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较,ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。【结论】 miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬,在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。

submitted time 2019-03-05 From cooperative journals:《中国生物工程杂志》 Hits27804Downloads1364 Comment 0

2. chinaXiv:201810.00011 [pdf]

双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选

方媛; 徐广贤; 王羡; 王红霞; 潘俊斐
Subjects: Biology >> Bioengineering

目的:构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。 方法:采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E.coil TG1 构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。 结果:构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66.17%,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×1012 CFU/ml。在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。结论:成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。

submitted time 2018-10-09 From cooperative journals:《中国生物工程杂志》 Hits2140Downloads1155 Comment 0

3. chinaXiv:201712.00686 [pdf]

GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞成熟和功能的调控作用

褚帅; 李海侠; 李欣; 康霞; 黄清水; 王红霞; 裘宇容
Subjects: Medicine, Pharmacy >> Preclinical Medicine

目的 探讨GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟和功能的调控作用。方法 脂多糖催熟BMDC,Western blotting检测刺激前后糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的磷酸化水平的改变;利用GSK-3β的选择性抑制剂SB216763处理BMDC,检测表型、细胞因子表达和混合淋巴反应(MLR)的变化情况;构建过表达小鼠GSK-3β的慢病毒载体并转染DC2.4细胞,Westernblotting检测过表达GSK-3β对调控树突状细胞(DC)成熟的关键调控因子鸟的网状内皮组织增生病毒癌基因相关B(RelB)蛋白水平的影响。结果 经脂多糖处理后,GSK-3βY216磷酸化水平下调,Ser9磷酸化水平显著上调,表明GSK-3β的活性显著下降。抑制GSK-3β的活性能上调DC表面共刺激分子CD40和CD86的表达,削弱脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-12表达上调,而对抗炎细胞因子IL-10的表达有促进作用,同时降低脂多糖诱导成熟的DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力。在未成熟的DC2.4细胞中,过表达GSK-3β能够下调RelB的水平。结论 GSK-3β参与调控DC的成熟和功能,高活性的GSK-3β抑制未成熟树突状细胞(iDC)的自发性成熟,GSK-3β失活后促进DC表型的成熟,而在脂多糖诱导DC分化的过程中GSK-3β发挥促炎作用。GSK-3β能够下调RelB的蛋白水平,有望成为构建新型耐受性DC的新靶点。

submitted time 2017-12-07 From cooperative journals:《南方医科大学学报》 Hits755Downloads443 Comment 0

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