分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-12-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501β-葡萄糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其相对分子量和比酶活分别为86.63 kDa和675.56 U/mg。最适作用温度和pH分别为30 ℃和6.5。 Mg2+和Ca2+对β-葡萄糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu2+几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的Km和Vmax分别为1.44 mM和58.32 mM s-1,催化系数kcat为3982 s-1。结果与分析表明来源于副干酪乳杆菌TK1501β-葡萄糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-03-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 胆固醇氧化酶专一性地催化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮,广泛地应用于临床以及食品加工行业。本论文将来源于Pimelobacter simplex的胆固醇氧化酶PsCO4,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和C41(DE3)中,在不同温度(15 ℃、25 ℃、37 ℃)及IPTG诱导浓度(0.01 mM、 0.1 mM、0.5 mM)下异源表达PsCO4。结果表明,转入Rosetta(DE3)菌株的PsCO4蛋白,在IPTG浓度为0.1 mM、15 ℃下经18 h诱导表达,PsCO4可溶性表达量最高(0.63 mg/ml)。异源表达的胆固醇氧化酶PsCO4最适温度为30 ℃,最适pH为7.5。通过TLC, GC-MS检测出PsCO4催化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。以胆固醇和β-谷甾醇、豆甾醇和孕烯醇酮为底物,测定PsCO4对四种底物的催化反应动力学参数,胆固醇kcat /Km 为0.08 s-1·M-1分别高于β-谷甾醇(0.04 s-1·M-1)、豆甾醇(0.005s-1·M-1)和孕烯醇酮(0.02 s-1·M-1)。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-06-01 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶,临床上用胆固醇氧化酶作为检测血清胆固醇含量的应用潜力巨大。将来源于红球菌Rhodococcus ruber的胆固醇氧化酶ChOG,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,在不同条件下进行诱导表达,结果表明:BL21(DE3)菌株在诱导温度为16 ℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L时,ChOG可溶性表达量最高 (0.49 mg/mL)。ChOG的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。最适反应条件下,酶活性达到8.033 U/mg。利用TLC、HPLC对ChOG催化产物胆甾-4-烯-3-酮进行了鉴定分析。三维结构及定点突变分析表明Glu406及Arg408、Glu261在进行胆固醇C3羟基的脱氢、质子传递,以及底物异构化发挥重要作用。