Subjects: Biology >> Bioengineering submitted time 2018-12-25 Cooperative journals: 《中国生物工程杂志》
Abstract：目的 构建能够用于稳定动态监测细胞自噬流变化和过表达基因的红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-鼠源LC3融合慢病毒多功能表达载体(PCDH-Duo-mRFP-eGFPph-LC3rat，PCDH-Duo) , 并构建小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7稳转株观察自噬流变化。方法 应用基于PCR精确合成mRFP-eGFPph-LC3rat融合全基因，将其克隆至慢病毒表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP中，重组质粒经菌落PCR、酶切及测序分析正确无误后, 包装慢病毒，转染Raw264.7细胞，并利用流式分选术获取稳转株，经氯喹抑制自噬模型及Western blotting鉴定eGFP蛋白表达确认其可靠性。结果 成功构建了PCDH-Duo重组慢病毒质粒，包被慢病毒并获得Raw264.7稳定细胞系(Raw264.7-PCDH-Duo)，可稳定表达双荧光蛋白，经3 mM氯喹作用6h后，能够稳定准确指示自噬流变化。结论 成功构建了基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统，为研究细胞自噬与编码基因及非编码基因之间的关系提供了方便有力的工具。
Subjects: Biology >> Bioengineering submitted time 2018-07-15 Cooperative journals: 《中国生物工程杂志》
Abstract：星形胶质细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）在多种肿瘤中过表达，参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中，通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性；然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系，并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率；最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示，成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体，所构建的载体与实验设计相一致，通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性；成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系，Western blot实验结果表明敲除效率高达98％；Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。
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