分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体，实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达，提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架，设计并全基因合成双基因克隆表达元件，连接到骨架载体，构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100％。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达，并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。
分类： 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间： 2022-07-05 合作期刊: 《广西植物》
摘要： 绣球 (Hydrangea macrophylla) 是以花序为主要观赏部位的园林植物，多用作切花装饰和景观营造，在亚洲、美洲、欧洲广泛栽培。为探究 AP3 基因在绣球花萼形成过程中的功能，加快重瓣绣球新品种培育进程，该研究以绣球‘杜丽’为材料，克隆其 MADS-box B 类基因 HmAP3，并结合生物信息学方法预测基因功能；根据 HmAP3 序列信息，筛选出高特异性编辑靶点并构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体，通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中。结果表明：(1) HmAP3 全长 546 bp，共编码 181 个氨基酸，测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为 100%，与拟南芥 AtAP3 相似度为 58.8%；(2)不同属植物 AP3氨基酸序列差异较大，在同属不同物种中 AP3 蛋白主要结构则较为保守，仅在少数基序上存在差异；(3)在 HmAP3 中共鉴定到 2 个高特异性靶点，并成功构建 2 个单靶点 CRISPR/Cas9基因编辑载体；(4)本研究共获得 5 株基因组内含有 Cas9 序列的抗性芽，但其靶点均未突变，在抗性芽中没有检测到 Cas9 表达。本研究探讨了 AP3 基因在重瓣绣球育种中的价值，对绣球的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行了初探，为绣球优良品种繁育工作奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的 构建能够用于稳定动态监测细胞自噬流变化和过表达基因的红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-鼠源LC3融合慢病毒多功能表达载体(PCDH-Duo-mRFP-eGFPph-LC3rat，PCDH-Duo) , 并构建小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7稳转株观察自噬流变化。方法 应用基于PCR精确合成mRFP-eGFPph-LC3rat融合全基因，将其克隆至慢病毒表达载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP中，重组质粒经菌落PCR、酶切及测序分析正确无误后, 包装慢病毒，转染Raw264.7细胞，并利用流式分选术获取稳转株，经氯喹抑制自噬模型及Western blotting鉴定eGFP蛋白表达确认其可靠性。结果 成功构建了PCDH-Duo重组慢病毒质粒，包被慢病毒并获得Raw264.7稳定细胞系(Raw264.7-PCDH-Duo)，可稳定表达双荧光蛋白，经3 mM氯喹作用6h后，能够稳定准确指示自噬流变化。结论 成功构建了基于慢病毒系统的双荧光标记多功能自噬流监测系统，为研究细胞自噬与编码基因及非编码基因之间的关系提供了方便有力的工具。
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